Как проверить чистоту пептидов:Разработчик: HPLC, MS & COA Playbook

Почему пептидная чистота имеет значение

Чистота пептидов является единственной наиболее последовательной переменной в любом протоколе исследования пептидов. Пептид, помеченный 95% чистоты, содержит, по определению, до 5% другого материала — усеченные последовательности, продукты окисления, пептиды делеции, побочные продукты рацемизации, остаточные растворители, соли и воду. При 90% чистоте эта же пятипроцентная маржа удваивается. В работе с дозой-ответом профиль примесей 5% может сместить очевидные значения EC50, создать неожиданную перекрестную реактивность рецептора и сбить с толку эксперименты по передаче сигналов. В исследованиях на животных те же примеси могут вызывать реакции на месте инъекции, изменять фармакокинетику или в редких случаях вызывать иммуногенные реакции, совершенно не связанные с родительским пептидом.

Помимо экспериментальной точности, проверка чистоты является базовой проверкой доверия поставщика. Пептидная промышленность включает в себя сложных, хорошо оснащенных производителей и столь же большую параллельную экосистему реселлеров, которые переупаковывают объемный материал без контроля качества. Без независимой проверки исследователи не смогут отличить эталонный стандарт на 99% чистого фармацевтического класса от аналога на 70% чистого уличного уровня. Процесс проверки, описанный здесь, отделяет экспериментальную работу, которой можно доверять, от работы, которой нельзя доверять.

Что считается «высокой чистотой»

Согласно общепринятому мнению, пептиды, рекламируемые с чистотой >98%, считаются фармацевтическими или эталонными, >95% - исследовательскими и являются типичным полом для заслуживающей доверия лабораторной работы, а 90-95% приемлемы только для раннего скрининга или некритических применений. Ниже 90% изменчивость примесей затрудняет интерпретацию. Рекламируемое число чистоты, однако, бессмысленно, не видя хроматографических данных, которые его произвели.

HPLC: основной тест чистоты

Высокопроизводительная жидкостная хроматография является рабочей лошадкой анализа чистоты пептидов. Принцип прост: растворенный пептид проталкивается под высоким давлением через колонку, заполненную частицами кремнезема обратной фазы. По мере изменения подвижного фазового состава (обычно водно-ацетонитрильные градиенты с 0,1% трифторуксусной кислотой) пептиды элюируют при характерном времени удержания на основе их гидрофобности. УФ-детектор — почти всегда настроенный на 214 нм, где пептидные связи поглощают — регистрирует сигнал поглощения, когда каждый пик проходит через ячейку детектора.

Для каждого лота аналитическая лаборатория интегрирует область под каждым пиком. Чистота сообщается как площадь главного пика, деленная на общую интегрированную площадь, выраженную в процентах. Чистый пептид эталонного качества производит один острый пик, с любыми незначительными пиками, плотно сгруппированными непосредственно перед или после основного пика (часто последовательности делеции с одним остатком отсутствуют). Плохо синтезированный или неправильно хранящийся пептид производит лес вторичных пиков — четкий визуальный сигнал низкой чистоты независимо от номера заголовка.

Что искать в HPLC Trace

• Доминирующий пикс временем удержания, соответствующим ожидаемой гидрофобности последовательности.
• Интегрированная площадь ≥95%для основного пика (или ≥98% для фармацевтического класса).
• Симметричная пиковая формабез переднего плеча (что указывает на сопутствующую примесь) или хвостового оперения (что может указывать на перегрузку колонки или плохое разрешение).
• Базовый шум возвращается к нулюмежду пиками, что указывает на чистые инъекции и адекватную уравновешенность колонн.
• Задокументированная мобильная фаза, градиент, колонка и длина волны обнаруженияБез них след не интерпретируем.

Варианты метода HPLC

Обратная фаза HPLC (RP-HPLC) является стандартной, но специализированные пептиды требуют альтернативных подходов. Высокогидрофильные пептиды могут нуждаться в хроматографии гидрофильного взаимодействия (HILIC). Заряженные или ионные пептиды иногда используют ионообмен. Циклические пептиды и дисульфидно-сокращенные молекулы могут нуждаться в системах сверхвысокого давления (UHPLC) с колонками суб-2-микронных частиц для достижения адекватного разрешения. Заслуживающие доверия документы СОА, какой метод был использован и почему.

Масс-спектрометрия: подтверждение идентичности

HPLC показывает, насколько чист ваш образец. Масс-спектрометрия говорит вам, является ли чистая вещь пептидом, который вы заказали. Два теста отвечают на разные вопросы и одинаково важны: пептид, который на 99% чистый, но на 5% меньше по молекулярной массе, не является вашим пептидом, независимо от того, насколько чиста хроматограмма.

Для пептидной работы масс-спектрометрия электроспрей-ионизации (ESI-MS) является доминирующей техникой. Пептид ионизируется в тонкий аэрозоль, ускоряется через электрические и магнитные поля и обнаруживается на основе его соотношения массы к заряду. Поскольку пептиды, как правило, несут несколько зарядов (пептид 3000-Да обычно появляется в виде +2, +3 и +4 зарядовых состояний), деконвольтная нейтральная масса - это то, что сообщается. Матричная лазерная ионизация десорбции (MALDI-MS) является вторым распространенным методом, особенно полезным для больших пептидов и белков.

Что искать в отчете MS

• Измеренная моноизотопная или средняя молекулярная массав пределах 0,5 Да (или, лучше, 0,01% точности на приборах с высоким разрешением) теоретического веса, рассчитанного по опубликованной последовательности.
• Конверт зарядного устройстваВ ESI показан ожидаемый паттерн +2, +3, +4 ионов для типичного пептида 1000-4000 да.
• Теоретический расчет весапоказаны явно, поэтому вы можете самостоятельно проверить, что эталонное значение было вычислено правильно.
• Раскрытие измененийЕсли пептид амидированный, ацетилированный, биотинилированный или PEGylated, документированная масса должна отражать эту модификацию.

Tandem MS для проверки последовательностей

Для окончательной проверки идентичности последовательности, особенно на новых исследовательских пептидах, исследователи могут запросить данные фрагментации MS / MS. Пептид выбирается, фрагментируется внутри масс-спектрометра, и массы фрагментов совпадают с ожидаемыми сериями b- и y-ионов. Это золотой стандарт для подтверждения фактической аминокислотной последовательности, помимо простого соответствия молекулярной массы. Продавцы фармацевтического класса будут запускать MS / MS на каждой партии флагманского продукта; продавцы исследовательского класса обычно запускают его только при первой квалификации новой последовательности.

Чтение сертификата анализа

Сертификат анализа - это документ, который связывает HPLC, MS и другие измерения с конкретным количеством пептида, который вы получили. Настоящий COA - это одно- или двухстраничный PDF со встроенными хроматограммами, спектрами и конкретными значениями лотов. Фальшивый COA - это общая таблица с одинаковыми номерами на каждой партии, без данных приборов и сигнатур для каждой партии.

Обязательные элементы COA

• Название продукта и последовательностьиспользование однобуквенных или трехбуквенных аминокислотных кодов с отмеченными модификациями (например, Ac- для ацетила, -NH2 для амида, [Acm] для защитных групп).
• Лот номеркоторый соответствует номеру партии, напечатанному на этикетке флакона.
• Дата изготовления и анализаобычно в течение нескольких месяцев друг от друга.
• внешний вид(типичный: «от белого до небелого лиофилизированного порошка»).
• Растворимость(типичный: «растворимый в воде» или специфический сорастворитель, если гидрофобный).
• Чистота HPLCсо встроенной хроматограммой и деталями метода.
• Данные масс-спектрометрииТеоретическая и измеренная молекулярная масса.
• Контр-ионный контент(ацетат или трифторацетат, выраженный в процентах).
• Содержание воды(Карл Фишер или термогравиметрический анализ), как правило, 3–8%.
• Уполномоченная подписьАналитик или лаборатория QC.

Необязательно, но очень полезно

• Уровень эндотоксина по анализу лимулюс амебоцитарного лизата (LAL)
• Тестирование биоотягощения или стерильности для инъекционных применений
• Тяжелый металлический экран
• Анализ остаточных растворителей (DMF, DCM, метанол из синтеза)
• Чистый расчет содержания пептидов
• Стабильность данных из ускоренного хранения

Контр-ионы, содержание соли и чистый пептид

Пептиды обычно подаются в виде солей — чаще всего соли трифторацетата (TFA) из очистки RP-HPLC или соли ацетата из ионообменной очистки. Противоион связывается с положительно заряженными остатками пептида и способствует общей массе порошка. Флакон с надписью «10 mg пептида» может фактически содержать 8,5 mg чистого пептида и 1,5 mg контриона плюс остаточная вода.

Для большинства экспериментальных работ это нормально — чистое содержание пептидов имеет значение для дозирования, и надежный COA сообщает об этом явно. Однако для работы с чувствительной клеточной культурой или дозирования in-vivo контрионы TFA могут вводить тонкие проблемы: они могут мешать определенным биологическим анализам, модулировать поведение клеточной мембраны при высоких концентрациях и усложнять исследования иммуногенности. Соли ацетата, как правило, предпочтительны для биологической работы; соли TFA распространены в химическом материале.

Чистый пептидный контент математика

Содержание чистого пептида рассчитывается как:(Mass of peptide vial) × (HPLC purity) × (1 − counter-ion fraction) × (1 − water fraction). Флакон 10 mg с 98% чистотой, 12% ацетатом и 5% водой фактически содержит 10 × 0,98 × 0,88 × 0,95 = 8,19 mg чистого пептида. Исследователи, которые пропускают этот расчет, обычно недодозируют свои эксперименты на 15-25%, что само по себе объясняет нетривиальную долю «невоспроизводимых» исследований пептидов.

Эндотоксин и соображения стерильности

Для культивирования клеток in vitro и инъекционной работы животных загрязнение эндотоксином является серьезной проблемой. Эндотоксины являются липополисахаридными фрагментами, пролитыми грамотрицательными бактериями во время ферментации или обработки, и они активируют иммунную сигнализацию в концентрациях, намного ниже видимой мутности. Анализ лимулус-амебоцитарного лизата (LAL) является стандартным тестом, результаты которого представлены в эндотоксинных единицах (EU) на mg пептида. Материалы фармацевтического класса нацелены на <0,5 EU/mg; материалы исследовательского класса приемлемы до нескольких EU/mg для работы in vitro, но должны фильтроваться или обрабатываться для использования на животных.

Стерильность, напротив, редко проверяется на пептидных порошках, потому что лиофилизация сама по себе снижает микробную нагрузку, и конечные пользователи обычно восстанавливаются с бактериостатической водой в асептических условиях. Однако для долгосрочного восстановления хранения рост бактерий в плохо сохранившихся растворах является реальным риском и еще одной причиной для фильтрации через мембраны 0,22 мкм, когда биообременение неопределенно.

Красные флаги и модели продавцов

Наиболее распространенным недостатком качества при покупке исследовательского пептида является прием маркетинговых материалов вместо аналитических данных. Продавцы, которые не проходят проверку чистоты, разделяют узнаваемую модель: они заменяют язык доказательствами и полагаются на объем продаж, а не на долгосрочные отношения исследователей.

• «Типическая чистота» или «≥98%» без специфичных для лотов данных:Настоящий COA печатает измеренное число из конкретного запуска инструмента, а не из общей спецификации.
• Идентичные числа в нескольких лотах:Реальный синтез варьируется. Если три разных лота сообщают о чистоте 98,7% до десятичного знака, документ шаблонен, а не измерен.
• Хроматограммы или спектры:Некоторые производители повторно используют одно и то же изображение хроматограммы в разных продуктах. Тождественные следы на разных пептидах на уровне пикселей являются неоспоримым доказательством.
• Сравнение молекулярной массы с теоретической и измеренной:COA без теоретического расчета веса не может быть независимо проверен.
• Отказ в предоставлении COA перед покупкой:Большинство законных поставщиков отправляют дезинфицированные COA по запросу. Удержание их до момента оплаты является предупреждением о контроле качества.
• Агрессивный медицинский маркетинг только для исследовательских продуктов:Продавец, продающий пептиды «FDA-класса» или «фармацевтического класса» при работе под лицензией только для исследований, искажает либо нормативную категорию, либо сам продукт.
• Невероятно низкие цены:Синтез твердофазных пептидов при высокой чистоте действительно дорог; цены, существенно ниже рыночных норм, обычно указывают на недодозированный, нечистый или контрафактный продукт.
• Много чисел, которые изменяются, но COA, которые не:Отслеживание лотов должно производить многоспецифические PDF-файлы. Если три разных флакона дают три одинаковых COA с измененным только числом, COA являются декоративными.

Практический рабочий процесс проверки партии

Для исследователей, которым нужен повторяемый рабочий процесс, нижеприведенные шаги охватывают девяносто пять процентов рутинной проверки качества без специализированного оборудования.

1. Получить лотс неповрежденной этикеткой. Подтвердите, что название пептида, номер партии, вес и условия хранения соответствуют порядку.
2. Скачать Lot-specific COAс портала поставщика или запросить его напрямую. Проверить номер лота на COA соответствует флакон.
3. Откройте встроенную хроматограмму. Проверить один доминирующий пик, площадь ≥95% и детали метода (колонка, подвижная фаза, длина волны).
4. Откройте встроенный масс-спектр. Вычислите теоретическую молекулярную массу из опубликованной последовательности и подтвердите соответствие измеренного веса в пределах допуска прибора.
5. Обратите внимание на воду и противоионные фракциии вычислить чистое содержание пептида для точного дозирования.
6. Если эксперимент является сигнально-чувствительнымПроверить, соответствует ли уровень эндотоксина вашему порогу или обработать материал через фильтр 0,22 мкм или колонку удаления эндотоксина.
7. Если последовательность новазапросить данные фрагментации MS/MS или провести независимую проверку личности.
8. Архивная копия COAС лабораторной тетрадкой аналитическая родословная каждого эксперимента воспроизводима.

Независимое повторное тестирование

Для работы с высокими ставками отправка небольшого аликота лота в независимую контрактную лабораторию для проверки HPLC и MS стоит скромных затрат. Независимое повторное тестирование является единственной реальной защитой от мошеннических СОА. Несколько коммерческих лабораторий предлагают услуги быстрого обхода пептида QC менее чем за несколько сотен долларов за образец.

Хранение, стабильность и повторное тестирование

Чистота пептидов на момент получения является лишь отправной точкой. Неправильное хранение разлагает пептиды, иногда быстро. Лиофилизированный пептид, хранящийся при −20 °C в запечатанном флаконе, обычно стабилен в течение одного-двух лет, иногда дольше. После восстановления в бактериостатической воде большинство пептидов стабильны в течение одной-двух недель при 2-8 °C и несколько недель замороженны при -20 °C. Остатки аспарагиновой кислоты, метионина и цистеина особенно восприимчивы к окислению, деамидации или дисульфидному скремблированию.

Хранить лучшие практики

• Получать лиофилизированный пептид и хранить при −20 °C в морозильной камере до использования.
• Позвольте флакону нагреваться до комнатной температуры в течение 15-20 минут перед открытием, чтобы предотвратить конденсацию влаги.
• Восстановление с бактериостатической водой в концентрациях, которые позволяют точное пипетание (обычно 1-2 mg / mL).
• Aliquot реконструировал пептид в одноразовые объемы, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания, которые разрушают структуру.
• Для длительного восстановленного хранения замораживание при −80 °C; для рутинной работы −20 °C допустимо в течение одного месяца.

Когда повторно тестировать

Повторные испытания много, если он был сохранен после 18 месяцев, подвергался повторным температурным экскурсиям или использовался в неожиданно переменных экспериментах. Видимое обесцвечивание, сгущение, неприятные запахи или изменения в растворимости - все это сигналы, что чистота изменилась. Простой повторный запуск HPLC является самым быстрым способом подтвердить, остался ли лот в спецификации.

Рекомендуемые поставщики исследований

Для исследователей, занимающихся поиском соединений, обсуждаемых в этой статье, следующие поставщики поддерживают стороннее тестирование чистоты, прозрачный поиск и установленную репутацию в исследовательском пептидном сообществе. WolveStack получает небольшую комиссию за указанные покупки, которая финансирует нашу исследовательскую и письменную работу — это не влияет на нашу редакционную оценку каждого поставщика.

Часто задаваемые вопросы