Jak sprawdzić czystość peptydu:HPLC, MS & COA

Dlaczego dotyczy czystości peptydu

Czystość peptydu jest najbardziej konsekwentną zmienną w każdym protokole badań peptydowych. Peptyd oznaczony 95% czystości zawiera, z definicji, do 5% innych materiałów - okrojone sekwencje, produkty utleniania, peptydy usuwające, produkty uboczne racemizacji, rozpuszczalniki pozostałości, sole i woda. Przy 90% czystości ten sam pięcioprocentowy margines podwaja. W pracy nad odpowiedzią na dawkę, 5% profil zanieczyszczeń może zmienić pozorne wartości EC50, stworzyć niespodziewaną reaktywność receptorów i mylić dalsze eksperymenty sygnalizacyjne. W badaniach na zwierzętach te same zanieczyszczenia mogą powodować reakcje w miejscu wstrzyknięcia, zmianę farmakokinetyki lub, w rzadkich przypadkach, wywołać odpowiedź immunologiczną całkowicie niezwiązaną z macierzystym peptydem.

Poza eksperymentalną wiernością, weryfikacja czystości jest podstawową kontrolą zaufania. Przemysł peptydowy obejmuje wyrafinowanych, dobrze wyposażonych producentów i równie duży równoległy ekosystem sprzedawców, którzy przepakowują masowe materiały bez kontroli jakości. Bez niezależnej weryfikacji badacze nie mają możliwości odróżnienia 99% czystego wzorca farmaceutycznego od 70% czystego analogu ulicznego. Opisany tutaj proces weryfikacji oddziela pracę eksperymentalną, której można ufać i której nie można powielać.

Co liczy się jako "wysokiej czystości"

Zgodnie z powszechnie przyjętą konwencją peptydy o czystości > 98% są uważane za klasy paranormalne lub jakości referencyjnej, > 95% jest klasy naukowej i jest typowym podpórkiem dla wiarygodnych prac laboratoryjnych, a 90- 95% jest akceptowalne tylko dla wczesnych badań przesiewowych lub zastosowań niekrytycznych. Poniżej 90% zmienność zanieczyszczeń utrudnia interpretację. Zareklamowany numer czystości jest jednak bez znaczenia, nie widząc danych chromatograficznych, które go wyprodukowały.

HPLC: Badanie czystości rdzenia

Wysokowydajna chromatografia cieczowa jest koniem roboczym analizy czystości peptydów. Zasada jest prosta: rozpuszczony peptyd jest pchany pod wysokim ciśnieniem przez kolumnę wypełnioną cząsteczkami krzemionki w fazie cofania. W miarę zmiany składu fazy ruchomej (zazwyczaj gradienty wody-acetonitrylu z 0,1% kwasem trifluorooctowym) peptydy eluują w charakterystycznych czasach retencji na podstawie ich hydrofobii. Detektor UV - prawie zawsze dostrojony do 214 nm, gdzie absorbują się wiązania peptydowe - rejestruje sygnał absorbujący, gdy każdy szczyt przechodzi przez komórkę detektora.

Dla każdej partii laboratorium analityczne integruje obszar pod każdym szczytem. Czystość jest zgłaszana jako powierzchnia głównego piku podzielona przez całkowity zintegrowany obszar wyrażony jako procent. Czysta peptyd o jakości referencyjnej wytwarza pojedynczy ostry szczyt, przy czym wszelkie niewielkie szczyty są szczelnie skupione bezpośrednio przed lub po głównym szczycie (często sekwencje usuwania z jednej pozostałości brakuje). Słabo zsyntetyzowany lub niewłaściwie przechowywany peptyd wytwarza las wtórnych szczytów - wyraźny wizualny sygnał niskiej czystości niezależnie od numeru głównego.

Czego szukać w HPLC Trace

• Jeden dominujący szczytz czasem retencji odpowiadającym spodziewanej hydrofobowości sekwencji.
• Obszar zintegrowany ≥ 95%dla głównego piku (lub ≥ 98% dla klasy farmaceutycznej).
• Symetryczny kształt pikubez stosowania wstępnego (co wskazuje na zanieczyszczenie współwydzielające) lub śledzenie (co może wskazywać na przeciążenie kolumn lub złą rozdzielczość).
• Hałas wyjściowy, który powraca do zeramiędzy szczytami, wskazując czyste wstrzyknięcia i odpowiednią równowagę kolumn.
• udokumentowana faza ruchoma, gradient, kolumna i długość fali detekcji- bez nich ślad jest nie do zrozumienia.

Zmienne metody HPLC

HPLC w fazie odwróconej (RP- HPLC) jest standardem, ale specjalistyczne peptydy wymagają alternatywnego podejścia. Bardzo hydrofilowe peptydy mogą wymagać hydrofilowej chromatografii interakcji (HILIC). Naładowane lub jonowe peptydy czasami używają wymiany jonowej. W celu uzyskania odpowiedniej rozdzielczości cykliczne peptydy i cząsteczki dwusiarczanowe mogą potrzebować systemów ultra- wysokiego ciśnienia (UHPLC) z kolumnami cząstkowymi pod- 2-mikronów. Wiarygodne dokumenty COA, które zastosowano i dlaczego.

Spektrometria masowa: potwierdzenie tożsamości

HPLC mówi, jak czysta jest twoja próbka. Spektrometria masowa mówi, czy czystą rzeczą jest peptyd, który zamówiłeś. Te dwa badania odpowiadają na różne pytania i są równie ważne - peptyd, który jest 99% czysty, ale 5% zniżki w masie cząsteczkowej nie jest peptydem, bez względu na to, jak czysty chromatogram wygląda.

W przypadku pracy peptydowej główną techniką jest spektrometria masowa jonizacji elektrospray (ESI- MS). Peptyd jest zjonizowany w drobny aerozol, przyspieszony przez pola elektryczne i magnetyczne i wykrywany w oparciu o jego stosunek masy do ładunku. Ponieważ peptydy zazwyczaj posiadają wiele ładunków (3.000-Da peptyd często pojawia się jako + 2, + 3, i + 4 ładowania stany), dekonwolowana neutralna masa jest tym, co jest zgłaszane. Matrix- wspomagane laserowe desorpcji jonizacji (MALDI- MS) jest drugą wspólną techniką, szczególnie przydatną dla większych peptydów i białek.

Czego szukać w sprawozdaniu państwa członkowskiego

• Mierzone monoizotopy lub średnia masa cząsteczkowaw granicach 0,5 Da (lub lepszej, 0,01% dokładności na przyrządach wysokiej rozdzielczości) teoretycznej wagi obliczonej na podstawie opublikowanej sekwencji.
• Koperta z tytułu opłatw ESI wykazując spodziewany wzór + 2, + 3, + 4 jonów dla typowego 1 000-4 000 Da peptydu.
• Obliczanie masy teoretycznejpokazane wyraźnie, więc można niezależnie sprawdzić, że wartość referencyjna została obliczona poprawnie.
• Ujawnianie zmian- jeśli peptyd jest amidowany, acetylowany, biotinylowany lub PEGylowany, udokumentowana masa powinna odzwierciedlać tę modyfikację.

Tandem MS dla weryfikacji sekwencji

W celu ostatecznego sprawdzenia tożsamości sekwencji - zwłaszcza w odniesieniu do nowych peptydów badawczych - naukowcy mogą zażądać danych dotyczących fragmentacji MS / MS. Peptyd jest wybierany, rozdrobniony wewnątrz spektrometru masowego, a masa fragmentu pasuje do oczekiwanej serii b i yjonów. To złoty standard potwierdzający sekwencję aminokwasów, wykraczającą poza masę cząsteczkową. Dostawcy Pharmagrade będą uruchamiać MS / MS na każdej partii produktu flagowego; dostawcy badań zwykle uruchomić go tylko w pierwszej kwalifikacji nowej sekwencji.

Czytanie certyfikatu analizy

Certyfikatem analizy jest dokument, który łączy HPLC, MS i inne pomiary do określonej partii peptydu otrzymany. Prawdziwy COA to jeden lub dwa strony PDF z wbudowanymi chromatogramami, widmem i wartościami specyficznymi dla loterii. Fałszywy COA to ogólna tabela z tymi samymi numerami w każdej partii, bez danych o instrumencie i bez podpisu.

Obowiązkowe elementy COA

• Nazwa i sekwencja produktuprzy użyciu jedno- lub trzyliterowych kodów aminokwasów, z zanotowanymi modyfikacjami (np. Ac- dla acetylu, -NH δ dla amidu, [Acm] dla grup ochronnych).
• Numer partiipasuje do numeru partii wydrukowanego na etykiecie fiolki.
• Data produkcji i analizy, zwykle w ciągu kilku miesięcy od siebie.
• Wygląd(typowy: "proszek liofilizowany o barwie białej do białawej").
• Rozpuszczalność(typowy: "rozpuszczalny w wodzie" lub specyficzny współrozpuszczalnik, jeśli hydrofobowy).
• Czystość HPLCz wbudowanym chromatogramem i szczegółami metod.
• Dane dotyczące spektrometrii masowejz teoretyczną i zmierzoną masą cząsteczkową.
• Zawartość kontrjonów(octan lub trifluorooctan, wyrażony jako procent).
• Zawartość wody(Karl Fischer lub analiza termograwimetryczna), zazwyczaj 3- 8%.
• Podpis zatwierdzającyod analityka QC lub laboratorium.

Opcjonalne, ale bardzo przydatne

• Poziom endotoksyny metodą limulus amebocyte lisate (LAL)
• Bioburden lub badanie sterylności w przypadku zastosowań do iniekcji
• Ekran metalowy ciężki
• Analiza pozostałości rozpuszczalnika (DMF, DCM, metanol z syntezy)
• Obliczanie zawartości peptydu netto
• Dane dotyczące stabilności z przyspieszonego przechowywania

Przeciwciała, zawartość soli i peptyd netto

Peptydy są zazwyczaj dostarczane jako sole - najczęściej trifluorooctan (TFA) z oczyszczania RP- HPLC lub octan z oczyszczania jonowymiennego. Przeciwjon jest związany z dodatnio naładowanymi pozostałościami peptydu i przyczynia się do całkowitej masy proszku. Fiolka z napisem "10 mg peptydu" może zawierać 8, 5 mg peptydu netto i 1, 5 mg jonu kontrastowego z pozostałością wody.

Dla większości prac eksperymentalnych jest to w porządku - zawartość peptydu netto jest tym, co ma znaczenie dla dawkowania, a wiarygodne COA informuje to wyraźnie. W przypadku pracy z kulturą wrażliwą lub podawania w warunkach in vivo przeciwciała TFA mogą jednak powodować subtelne problemy: mogą one zakłócać niektóre testy biologiczne, modulować zachowanie błony komórkowej w wysokich stężeniach oraz komplikować badania immunogenności. Sole octanowe są na ogół preferowane w badaniach biologicznych; sole TFA są powszechne w materiałach chemicznych.

Zawartość peptydu netto Matematyka

Zawartość peptydu netto oblicza się jako:(Mass of peptide vial) × (HPLC purity) × (1 − counter-ion fraction) × (1 − water fraction). 10 fiolek mg o czystości 98%, 12% octanu i 5% wody zawiera 10 × 0,98 × 0,88 × 0,95 = 8,19 mg peptydu netto. Naukowcy, którzy pomijają te obliczenia rutynowo niedowalają swoich eksperymentów o 15- 25%, co samo w sobie wyjaśnia nietrywialny ułamek "niepowtarzalnych" badań peptydowych.

Uwagi dotyczące endotoksyny i sterylności

W przypadku hodowli komórek in vitro i wykonywania iniekcji u zwierząt, zanieczyszczenie endotoksyną jest głównym problemem. Endotoksyny są fragmentami lipopolisacharydów, które bakterie Gram- ujemne rozlewają podczas fermentacji lub obchodzenia się z nimi i aktywują sygnały immunologiczne w stężeniach znacznie poniżej widocznej mętności. Test limulus amebocyte lisate (LAL) jest badaniem standardowym, z wynikami zgłaszanymi w jednostkach endotoksyny (UE) na mg peptydu. Docelowy poziom materiałów do badań farmakoterapeutycznych < 0, 5 EU / mg; materiał do badań jest dopuszczalny do kilku poziomów w UE / mg w przypadku prac in vitro, ale powinien być filtrowany lub przetwarzany do użytku zwierzęcego.

Natomiast sterylność jest rzadko badana na proszku peptydowym, ponieważ sama liofilizacja zmniejsza obciążenie mikrobiologiczne i użytkownicy końcowi zazwyczaj rozpuszczają się w wodzie bakteriostatycznej w warunkach aseptycznych. W przypadku długotrwałego, odtworzonego przechowywania, wzrost bakterii w słabo zachowanych roztworach jest prawdziwym ryzykiem i kolejnym powodem do filtrowania przez błony 0,22- μm, gdy bioburden jest niepewny.

Czerwone flagi i wzory Vendor

Najczęstszą wadą jakości w zakupie peptydu badawczego jest akceptacja materiałów marketingowych zamiast danych analitycznych. Sprzedawcy, którzy nie sprawdzają czystości, mają rozpoznawalny wzór: zastępują język dowodami i polegają raczej na sprzedaży wolumenu niż na długotrwałych relacjach z naukowcami.

• "Czystość typowa" lub "≥ 98%" bez danych specyficznych dla lotosu:Prawdziwe COA drukuje zmierzony numer z konkretnego uruchomienia instrumentu, a nie ogólną specyfikację.
• Identyczne numery w wielu partiach:Prawdziwa synteza jest różna. Jeżeli trzy różne partie stanowią 98,7% czystości do dziesiętnej, dokument jest topliwy, a nie mierzony.
• Chromatogramy lub spektra:Niektórzy dostawcy używają tego samego obrazu chromatogramu w produktach. Identyczne ślady na różnych peptydach na poziomie pikseli są jednoznaczne.
• Brak porównania masy cząsteczkowej mierzonej teoretycznie:Nie można niezależnie zweryfikować COA bez teoretycznego obliczenia masy.
• Odmowa dostarczenia COA przed zakupem:Większość legalnych sprzedawców wysyła na życzenie oczyszczone koagulanty. Wstrzymanie ich do czasu zapłaty jest ostrzeżeniem o kontroli jakości.
• Agresywny marketing medyczny wyłącznie dla produktów badawczych:Sprzedawca sprzedający peptydy "klasy FDA" lub "klasy farmaceutycznej" w czasie prowadzenia działalności w ramach licencjonowania wyłącznie w zakresie badań naukowych błędnie przedstawia kategorię regulacyjną lub sam produkt.
• Niewiarygodnie niskie ceny:Solidfazowa synteza peptydów przy wysokiej czystości jest rzeczywiście kosztowna; ceny znacznie poniżej norm rynkowych zwykle wskazują na niedotlenione, nieczytelne lub podrobione produkty.
• Numery partii, które się zmieniają, ale COA, które nie:Śledzenie partii powinno produkować wiele specyficznych plików PDF. Jeśli trzy różne fiolki dają trzy identyczne COA z tylko zmieniony numer, COA są dekoracyjne.

Praktyczny przepływ weryfikacji partii

Dla badaczy, którzy chcą powtarzalnego przepływu pracy, poniższe kroki obejmują dziewięćdziesiąt pięć procent rutynowej weryfikacji jakości bez specjalistycznego sprzętu poza tym, do czego większość laboratoriów ma już dostęp.

1. Otrzymuj partięz nienaruszoną etykietą fiolki. Potwierdzić nazwę peptydu, numer partii, wagę i warunki przechowywania zgodne z zamówieniem.
2. Pobierz COA specyficzne dla loteriiz portalu sprzedawcy lub zażądać go bezpośrednio. Sprawdzić numer partii na COA pasuje do fiolki.
3. Otwórz wbudowany chromatogram. Sprawdzić pojedynczy szczyt dominujący, obszar ≥ 95% oraz szczegóły dotyczące metody (kolumna, faza ruchoma, długość fali).
4. Otworzyć wbudowane widmo masowe. Obliczyć teoretyczną masę cząsteczkową z opublikowanej sekwencji i potwierdzić, że zmierzona masa odpowiada tolerancji przyrządu.
5. Uwaga: Frakcje wody i jonów kontrastowychi obliczyć zawartość peptydu netto dla dokładnego dawkowania.
6. Jeżeli eksperyment jest wrażliwy na znaki, sprawdzić poziom endotoksyny spełnia swój próg lub przetworzyć materiał poprzez filtr 0,22- μm lub kolumnę usunięcia endotoksyny.
7. Jeśli sekwencja jest nowa, zażądać danych dotyczących fragmentacji MS / MS lub przeprowadzić niezależną kontrolę tożsamości.
8. Archiwum COAwięc analityczny rodowód każdego eksperymentu jest odtwarzalny.

Niezależne ponowne badanie

Dla wysokiej stawki pracy, wysyłanie małej części partii do niezależnego laboratorium kontraktowego do HPLC i MS weryfikacji jest warte skromny koszt. Niezależne ponowne testy są jedyną prawdziwą obroną przed fałszywymi COA. Kilka komercyjnych laboratoriów oferuje szybkie usługi peptydowe QC za mniej niż kilkaset dolarów za próbkę.

Przechowywanie, stabilność i ponowny test

Czystość peptydu w momencie odbioru jest tylko punktem wyjścia. Niewłaściwe przechowywanie rozkłada peptydy, czasami szybko. Liofilizowany peptyd przechowywany w temperaturze -20 ° C w zamkniętej fiolce jest na ogół stabilny przez jeden do dwóch lat, czasami dłużej. Po rozpuszczeniu w wodzie bakteriostatycznej, większość peptydów jest stabilna przez 1 do 2 tygodni w temperaturze 2- 8 ° C i kilka tygodni w temperaturze -20 ° C. Pozostałości kwasu asparaginowego, metioniny i cysteiny są szczególnie podatne na utlenianie, deumidację lub mieszania disulfidu.

Przechowywanie najlepszych praktyk

• Do czasu użycia należy przyjąć liofilizowaną peptyd i przechowywać w temperaturze -20 ° C w zamrażarce wolnej od mrozów.
• Pozostawić fiolkę do ogrzania do temperatury pokojowej na 15- 20 minut przed otwarciem, aby zapobiec kondensacji wilgoci.
• Rozpuścić w wodzie bakteriostatycznej w stężeniu umożliwiającym dokładne pipetowanie (często 1-2 mg / mL).
• Elikot rekonstytuował peptyd do pojedynczych objętości, aby uniknąć powtarzających się cykli odwilżenia, które ulegają degradacji.
• W przypadku długotrwałego, odtworzonego przechowywania, zamrażać w temperaturze -80 ° C; w przypadku rutynowych czynności, -20 ° C jest dopuszczalne przez jeden miesiąc.

Kiedy ponownie sprawdzić

Przetestuj dużo, jeśli został przechowywany po 18 miesiącach, narażony na powtarzające się wycieczki temperaturowe lub używany w nieoczekiwanych eksperymentach zmiennych. Widoczne przebarwienia, grudki, odcieki lub zmiany rozpuszczalności są sygnałami, że czystość się zmieniła. Proste ponowne uruchomienie HPLC jest najszybszym sposobem potwierdzenia, czy partia pozostała w specyfikacji.

Recommended Research Vendors

W przypadku naukowców zajmujących się pozyskiwaniem związków, o których mowa w niniejszym artykule, następujący sprzedawcy utrzymują badania czystości trzeciej partii, przejrzyste pozyskiwanie i ustanowili reputację w środowisku peptydów badawczych. WolveStack zarabia niewielką prowizję od reklamowanych zakupów, które finansują nasze prace badawcze i pisarskie - nie ma to wpływu na naszą ocenę redakcyjną każdego sprzedawcy.

Często zadawane pytania