Интраназальный пептидАдминистрирование: полное руководство

Большинство исследователей пептидов по умолчанию делают подкожную инъекцию, не учитывая, что для некоторых соединений назальный спрей может дать сопоставимые или даже превосходные результаты. Исследование 2018 года, опубликованное вФармацевтические исследованияИнтраназальный инсулин достиг концентрации спинномозговой жидкости в 7 раз выше, чем внутривенная доставка в эквивалентных дозах, оспаривая давнее предположение, что инъекция всегда является золотым стандартом. Для определенного подмножества пептидов путь нос-мозг предлагает прямой путь, который обходит метаболизм первого прохода и, в некоторых случаях, сам гематоэнцефалический барьер.

Это руководство охватывает науку о доставке интраназальных пептидов, которые пептиды лучше всего подходят для него, практические методы подготовки и данные о биодоступности, которые исследователи должны знать, прежде чем выбирать путь их введения.

Наука, стоящая за доставкой интраназала

Полость носа — это гораздо больше, чем простой воздушный проход. Верхний носовой эпителий содержит обонятельную область — область примерно 10 см2 у людей — где обонятельные сенсорные нейроны проецируются непосредственно через кристаллическую пластину в обонятельную луковицу мозга. Этот анатомический ярлык является основой доставки лекарств от носа к мозгу, концепция, которая получила значительную поддержку в исследованиях нейробиологии за последние два десятилетия.

Существует три основных транспортных пути для интраназально вводимых соединений. Первый - обонятельный нервный путь, где молекулы транспортируются вдоль обонятельных нейронов через внутриклеточные или внеклеточные механизмы, чтобы достичь обонятельной луковицы и оттуда более глубоких структур мозга. Второй - тройничный нервный путь, который иннервирует дыхательный эпителий носовой полости и проецируется на ствол головного мозга, обеспечивая еще один прямой путь к центральной нервной системе. Третьим является системная абсорбция через богато васкуляризированную слизистую носа, которая функционирует аналогично инъекции путем доставки пептида в общую циркуляцию.

Для пептидов, которые нацелены на центральную нервную систему — ноотропы, анксиолитики, нейропротекторные агенты — первые два пути особенно ценны. Исследования Лоххеда и Торна (2012) показали, что интраназальная доставка больших молекул, включая пептиды и белки, может достигать концентраций в мозге, которые потребуют более высоких системных доз. Именно поэтому интраназальный Semax, Selank и окситоцин стали предметом интенсивного исследовательского интереса.

Биодоступность: интраназальный против инъекции

Биодоступность является критической переменной при сравнении путей введения, и данные сильно различаются в зависимости от рассматриваемого пептида. Небольшие, относительно липофильные пептиды, как правило, хорошо работают интраназально, в то время как более крупные пептиды сталкиваются со значительными барьерами поглощения.

Слизистая оболочка носа представляет несколько проблем для поглощения пептидов: слизистый клиренс подметает соединения к носоглотке в течение 15-20 минут, ферментативная деградация аминопептидазами и протеазами в носовом эпителии может расщеплять пептиды до их поглощения, а тесные соединения между эпителиальными клетками ограничивают параклеточный транспорт молекул, превышающих примерно 1000 далтонов.

Паттерн очевиден: пептиды под 1000 да с некоторой степенью липофильности, как правило, лучше всего работают интраназально. Semax и Selank были специально разработаны с учетом носовой доставки российскими фармацевтическими исследователями, что частично объясняет их сильную интраназальную производительность. Большим пептидам, таким как BPC-157 и большинству секретагогов гормона роста, не хватает профиля абсорбции, который сделал бы интраназальную доставку практичной без усилителей абсорбции.

Лучшие пептиды для интраназального введения

Не каждый пептид является кандидатом для носовой доставки. Основываясь на имеющейся научной литературе и опыте сообщества, пептиды наиболее часто и успешно используются через интраназальный путь.

Semax и NA-Semax

Semax, возможно, является плакатом ребенка для доставки интраназального пептида. Разработанный в Институте молекулярной генетики в России, он с самого начала разрабатывался как назальный спрей. Semax является синтетическим аналогом ACTH(4-10) с модифицированным C-концом, который улучшает устойчивость к ферментативной деградации. Его основные исследуемые эффекты включают повышение экспрессии BDNF, модуляцию серотонинергических и дофаминергических систем и нейрозащиту от окислительного стресса. N-ацетиловый вариант (NA-Semax) добавляет ацетиловую группу, которая дополнительно повышает стабильность и может увеличить потенцию. Исследовательская дозировка в литературе обычно колеблется от 200 до 600 mcg на одно введение, доставляемое 1-3 раза в день.

Selank и NA-Selank

Selank является синтетическим аналогом иммуномодулирующего пептида туфтсина, также разработанного в российских НИИ. Он был изучен в основном для анксиолитических и ноотропных эффектов, с исследованиями, демонстрирующими модуляцию экспрессии рецепторов ГАМК-А, влияние на IL-6 и метаболизм моноаминов, а также благоприятный профиль безопасности в доклинических моделях. Как и Semax, он был разработан для интраназального применения. Интраназальная биодоступность 60-80% делает его одним из наиболее поглощающих назальных пептидов. N-ацетиловая форма (NA-Selank) обеспечивает повышенную ферментативную стабильность и потенциально длительную продолжительность действия.

окситоцин

Интраназальный окситоцин был предметом сотен клинических исследований, исследующих его влияние на социальное познание, беспокойство, доверие и связь. В то время как системная биодоступность через нос довольно низкая (2-5%), клинические эффекты, наблюдаемые в испытаниях, убедительно свидетельствуют о значимой доставке ЦНС через прямые пути нос-мозг. В протоколах исследований обычно используется 20–40 IU, доставляемых с помощью калиброванных носовых распылителей. Систематический обзор 2020 года вПсихонейроэндокринологияБыло обнаружено, что интраназальный окситоцин вызывал измеримые поведенческие и нейровизуализационные эффекты в большинстве контролируемых испытаний, поддерживая жизнеспособность этого пути доставки для этого конкретного пептида.

Dihexa

Dihexa (N-гексаноик-Tyr-Ile-(6)-аминогексановый амид) представляет собой небольшой аналог ангиотензина IV, который показал замечательную потенцию в доклинических когнитивных исследованиях. Его относительно небольшой размер и липофильная гексаноильная группа делают его теоретически поддающимся носовой абсорбции. Некоторые исследователи исследовали интраназальную доставку, хотя опубликованные данные о биодоступности для этого маршрута остаются ограниченными. Потенция соединения при пикомолярных концентрациях означает, что даже умеренное всасывание носа может быть функционально релевантным.

Как приготовить пептидный назальный спрей

Подготовка назального спрея из лиофилизированного пептида требует внимания к стерильности, точных расчетов дозирования и соответствующего оборудования. Ниже описан стандартный метод лабораторной подготовки, задокументированный в протоколах исследований.

Оборудование необходимо

Исследователи обычно используют стерильную дозированную назальную баллончику (большинство доставляют 0,1 mL за приведение в действие), бактериостатическую воду (воду BAC) в качестве растворителя для восстановления, спиртовые тампоны для флаконов и стандартные шприцы для передачи. Некоторые протоколы требуют стерильного солевого раствора (0,9% NaCl) вместо воды BAC, особенно для чувствительных соединений или консервантов бензилового спирта.

Расчеты дозирования

Математика проста, но важна, чтобы быть правильной. Если назальный баллончик спрея доставляет 0,1 mL на насос, а целевая доза составляет 300 mcg на спрей, требуемая концентрация составляет 3 mg/mL (3000 mcg на mL). Для 5 флакона пептида mg восстановление с 1,67 mL воды BAC даст примерно 3 mg/mL. Большинство исследователей округляют до удобных объемов и соответствующим образом корректируют количество спреев на дозу.

Шаги подготовки

Общий лабораторный протокол включает в себя сначала очистку пептидной флаконной перегородки спиртовым тампоном, а затем медленное добавление расчетного объема воды BAC, направляя ее вниз по бокам флакона, а не непосредственно на лиофилизированный порошок, чтобы избежать деградации от механического стресса. После нежного закручивания (никогда не тряска) до полного растворения раствор вытягивается и переносится в носовую баллончик с распылением через отверстие или через шприц. Процесс прайминга — накачивание спрея несколько раз, пока не образуется постоянный туман — отнимает небольшое количество раствора, которое должно быть учтено в первоначальном расчете объема.

Правильная техника интраназального администрирования

Техника имеет большее значение, чем большинство исследователей. Плохо выполненное назальное введение может уменьшить эффективную доставку на 50% или более, причем большая часть дозы стекает в горло и проглатывается, а не поглощается через слизистую оболочку носа.

Протоколы исследований последовательно подчеркивают несколько технических элементов. Во-первых, мягкое очищение носа перед введением удаляет лишнюю слизь, которая действует как барьер. Однако следует избегать агрессивного продувания, так как это может вызвать временное воспаление слизистой оболочки. Во-вторых, голова должна быть слегка наклонена вперед (не назад), при этом распылительная бутылка слегка наклонена наружу к боковой носовой стенке, а не направлена на перегородку. Это нацелено на более абсорбирующий боковой эпителий и позволяет избежать менее васкуляризированной области перегородочного хряща.

В-третьих, нежный запах во время приведения в действие, а не резкий вдох, помогает распределить спрей по верхней носовой полости, не втягивая его слишком быстро в носоглотку. В-четвертых, чередующиеся ноздри между спреями распределяют дозу более равномерно и избегают насыщения всасывающей способности одной стороны. Наконец, оставаясь в вертикальном положении и избегая вздутия носа в течение по крайней мере 10-15 минут после введения дает пептиду время для поглощения, прежде чем слизистый клиренс заметает оставшийся раствор задом.

Усилители поглощения и стратегии формирования

Для пептидов с естественной плохой абсорбцией носа фармацевтические исследования выявили несколько стратегий улучшения биодоступности. Это в первую очередь относится к лабораторной разработке, а не к стандартной практике восстановления.

Циклодекстрины, особенно гидроксипропил-бета-циклодекстрин, улучшают поглощение назальных пептидов в 2-5 раз в некоторых исследованиях. Они работают путем временного увеличения проницаемости мембран и защиты пептидов от ферментативной деградации. Хитозан, биополимер, полученный из хитина, является еще одним хорошо изученным усилителем поглощения, который работает, временно открывая плотные соединения между эпителиальными клетками. Исследование, опубликованное вЖурнал контролируемого выпускаБыло продемонстрировано, что формируемый хитозаном назальный инсулин достиг биодоступности примерно в 3 раза выше, чем инсулин в простом солевом растворе.

Другие исследованные энхансеры включают алкилсахариды (особенно додекилмальтозид, используемый в одобренном FDA назальном спрее Valtoco diazepam), соли желчи, фосфолипиды и пептиды, проникающие в клетки. Тем не менее, стоит отметить, что многие усилители поглощения имеют компромисс: они могут вызывать раздражение слизистой носа при повторном использовании, что может парадоксальным образом уменьшить долгосрочное поглощение и вызывает вопросы безопасности для протоколов хронического введения.

Вопросы стабильности и хранения

Стабильность пептидов в составе назального спрея является практической проблемой, которая непосредственно влияет на результаты исследований. После восстановления в водном растворе пептиды значительно более уязвимы к деградации, чем в их лиофилизированной форме. Температура, рН, окисление и микробное загрязнение являются основными угрозами.

Большинство восстановленных пептидных назальных спреев следует хранить в холодильнике при температуре 2-8°C. Бактериостатическая вода обеспечивает некоторую антимикробную защиту благодаря содержанию бензилового спирта, но это не заменит надлежащего охлаждения и стерильной обработки. Исследовательские группы обычно готовят только достаточное количество раствора в течение 2-4 недель после использования, выбрасывая и готовя свежий раствор. Некоторые пептиды, особенно те, которые содержат остатки метионина, восприимчивы к окислению и могут извлечь выгоду из пробирок, очищенных азотом, и хранения, защищенного светом.

Важно отметить, что назальный распылитель сам по себе вводит переменные стабильности. Пластиковые и резиновые компоненты распылительных насосов могут адсорбировать пептиды из раствора, потенциально снижая концентрацию с течением времени. Этот эффект наиболее выражен гидрофобными пептидами и при низких концентрациях. Исследователи, изучающие эту проблему, обнаружили, что стеклянные флаконы с распылительными насосами с покрытием PTFE минимизируют адсорбционные потери по сравнению со стандартными пластиковыми устройствами.

Когда выбрать интраназальный против инъекции

Решение между интраназальным и инъекционным введением должно быть обусловлено конкретным пептидом, целью исследования и практическими соображениями. Ни один из маршрутов не является универсальным.

Интраназальная доставка явно предпочтительна для пептидов, нацеленных на ЦНС, таких как Semax, Selank и окситоцин, где прямой перенос нос-мозг обеспечивает фармакологическое преимущество, которое инъекция не может воспроизвести. Для этих соединений носовой путь не является компромиссным — это оптимальный способ доставки, поддерживаемый конструкцией самих пептидов и весом опубликованной литературы.

Инъекционное введение остается четким выбором для системных пептидов, таких как BPC-157, TB-500, секретагоги гормона роста (CJC-1295, Ipamorelin, GHRP-2/6) и любого пептида, где первичной целью исследования является воздействие периферических тканей. Преимущество биодоступности подкожной инъекции (обычно 65-100% в зависимости от пептида) намного превышает то, чего может достичь назальная доставка для большинства этих соединений.

Существует серая зона для пептидов, где оба маршрута имеют некоторые подтверждающие данные, но ни один из них не является окончательным. В этих случаях исследователи должны взвесить факторы, включая конкретную мишень ткани, важность ЦНС по сравнению с системным воздействием, соображения соответствия субъекта (назальные спреи менее инвазивны) и доступные фармакокинетические данные для каждого маршрута с конкретным соединением, о котором идет речь.

Ограничения и практические вызовы

Доставка интраназальных пептидов не обходится без проблем, и исследователи должны знать о нескольких практических ограничениях, которые могут повлиять на экспериментальные результаты.

Заложенность носа, аллергия и инфекции верхних дыхательных путей могут значительно уменьшить абсорбцию. Даже легкое воспаление слизистой изменяет характеристики проницаемости носового эпителия непредсказуемым образом. Сезонные аллергики могут наблюдать значительную изменчивость в поглощении пептидов в течение года. Кроме того, использование назальных противоотечных спреев (оксиметазолин, фенилэфрин) вызывает вазоконстрикцию, которая может уменьшить поглощение пептидов, ограничивая приток крови к всасывающей слизистой оболочке.

Воспроизводимость дозы является еще одной проблемой. В отличие от инъекции, где доставляемая доза точно контролируется объемом шприца, доставка назального спрея имеет присущую изменчивость. Измеренные дозы насосов, как правило, имеют ±10-15% коэффициент изменения объема выпуска, а индивидуальные различия в анатомии носа, производстве слизи и технике вносят дополнительную изменчивость. Для исследований, требующих жесткого контроля дозы, эта неточность может быть проблематичной.

Наконец, общий объем, который можно вводить интраназально, ограничен. Каждая ноздря может эффективно поглощать примерно 150-200 мкл до возникновения стока, устанавливая практический потолок около 400 мкл на одно событие введения. Для пептидов, требующих высоких доз, это ограничение объема может потребовать высококонцентрированных составов или множественных событий дозирования, разделенных друг на друга.

Часто задаваемые вопросы